Microbiologia Online

Microbiologia Online com Foco em: Coloração de Gram

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Thu, 02 Dec 2010 22:53:00 +0000

Apesar de descrita há mais de 200 anos (1884) por Christian Gram, a coloração de Gram é uma ferramenta rápida e barata de diagnóstico do tipo de parede celular da bactéria em estudo, ainda amplamente utilizada.

A técnica consiste basicamente nas seguintes etapas:

Preparar uma lâmina de vidro com uma fina camada de bactérias fixa (esfregaço);
Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
Cobrir com lugol por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
Descorar com solução de álcool-acetona por 30 segundos. Enxaguar em água corrente;
Contra-corar com safranina (ou fucsina) por 30 segundos. Enxaguar em água corrente.
Deixar secar ao ar.

Uma bactéria é dita Gram negativa quando sua parede celular é incapaz de reter o corante cristal violeta, sendo corada somente pela safranina ou fucsina, que empresta sua coloração rosa às bactérias.

Já uma bactéria do tipo Gram positiva possui uma parede celular capaz de reter o cristal violeta, e por isso adquire coloração roxa ao microscópio.

Veja no esquema abaixo os passos da coloração e o que acontece a nível microscópico:

A figura abaixo mostra exemplos de bactérias, como são vistas ao microscópio, após sofrerem a coloração de Gram:

A coloração de Gram se baseia em algumas diferenças estruturais existentes entre a parede celular de uma bactéria Gram negativa e de uma Gram positiva. A principal delas é que a parede celular de uma bactéria Gram positiva, embora mais espessa, é quimicamente mais simples, ou seja, apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula (90% peptidioglicano). Veja figura abaixo:

Já a parede celular de uma bactéria Gram negativa é mais complexa. É formada por uma ou poucas camadas de peptidioglicano e por uma membrana externa, separadas entre si por um espaço periplásmico, contendo uma série de enzimas e proteínas. Enquanto nas Gram positivas o peptidioglicano representa de 15 a 50% da massa seca da célula, nas Gram negativas ele representa no máximo 5%.

Essas informações são importantes, pois é a quantidade de interligações existentes entre as cadeias de peptidioglicano e o comprimento dessas cadeias que determinará a forma da célula, e conseqüentemente, a forma da bactéria.Tanto as Gram positivas quanto as Gram negativas possuem, no entanto, uma característica em comum: suas membranas são constituídas de uma bicamada fosfolipídica.

Microbiologia Online com Foco em: Microscopia de Fluorescência (Parte VI)

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Mon, 04 Jan 2010 22:30:00 +0000

De maneira geral, a microscopia de fluorescência é muito semelhante à microscopia ultravioleta. A microscopia de fluorescência se baseia na propriedade que algumas substâncias possuem de emitirem fluorescência após absorverem energia ultravioleta. Em microbiologia, os microrganismos podem ser corados com um corante fluorescente, como o fluorocromo, para produzirem imagens fluorescentes ao microscópio UV.

A principal aplicação da microscopia de fluorescência em microbiologia é a técnica de identificação de reações imunológicas, ou seja, de reações antígeno-anticorpo. O fluorocromo se conjuga com o anticorpo e torna possível identificar células individuais que reagem com o anticorpo, através da emissão de fluorescência. Esta técnica é chamada de imunofluorescência.

Na imunofluorescência, uma cultura de células bacterianas é incubada com um anticorpo, o qual está conjugado com um corante fluorescente. Este conjugado antígeno-anticorpo poderá recobrir a superfície de algumas células, enquanto outras permanecerão sem o conjugado. Com o uso de luz ultravioleta, somente as células recobertas com o conjugado antígeno-anticorpo produzirão fluorescência e aparecerão brilhantes ao microscópio.

Créditos da imagem: Olympus Microscopy Resource Center - http://www.olympusmicro.com/

Próximo artigo: microscopia de contraste de fase.

Microbiologia Online com Foco em: Microscopia Ultravioleta (Parte V)

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Mon, 07 Dec 2009 21:46:00 +0000

Como visto anteriormente, em “Princípios dos Microscópios e Microscopia (Parte I)”, a microscopia luminosa se divide em seis subcategorias: microscopia de campo claro, microscopia de campo escuro, microscopia ultravioleta, microscopia de fluorescência, microscopia de contraste de fases e contraste de interferência diferencial (CID).

A microscopia ultravioleta é assim chamada por utilizar luz ultravioleta ao invés de luz branca comum, ou luz visível, como fonte de luz. A luz ultravioleta possui um comprimento de onda de 180 a 400 nm, muito menor que a luz visível, que é de 400 a 700 nm. Qual a vantagem?

Vamos recordar como se calcula o poder de resolução:

De acordo com a equação acima, quanto menor o comprimento de onda, menor o poder de resolução, o que significa que você conseguirá observar objetos ainda menores através do microscópio. Sendo assim, é possível concluir que a microscopia ultravioleta permite um aumento útil de cerca de duas vezes o aumento da microscopia de campo claro.

Além da vantagem de um aumento maior, com nitidez, a microscopia ultravioleta também possibilita a observação de substâncias que foram absorvidas pelos microrganismos e se tornam visíveis quando a luz ultravioleta incide sobre elas, geralmente se tornando fluorescentes. Esta é a principal aplicação da microscopia ultravioleta, ou seja, histoquímica.

O microscópio ultravioleta é diferente do microscópio convencional, pois uma vez que as radiações ultravioletas não são visíveis, as imagens são gravadas em um filme fotográfico, pelo uso de um tubo conversor de imagem ou pela projeção numa tela, depois de a imagem ser captada por um fototubo. Além disso, a microscopia ultravioleta necessita de lentes especiais para transmissão de luz ultravioleta e recursos ópticos para refletir a região de interesse, 230 a 350 nm.

Não perca o próximo artigo: microscopia de fluorescência.

Microbiologia Online com Foco em: Microscopia de Campo Escuro (Parte IV)

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Tue, 01 Dec 2009 23:00:00 +0000

Como vimos na Parte III deste mini-curso, na microscopia luminosa propriamente dita, também chamada de microscopia de campo claro, o objeto analisado apresenta-se escuro e o ambiente ao redor brilhantemente iluminado. Na microscopia de campo escuro, ocorre o inverso, ou seja, o objeto apresenta-se brilhantemente iluminado, em contraste com o fundo escuro.

Para conseguir seu objetivo, a técnica de microscopia de campo escuro faz uso de um tipo especial de condensador, capaz de fazer com que somente os raios luminosos que atingirem um objeto na lâmina entrem na objetiva.

Caso a lâmina contenha somente material transparente, como soro fisiológico ou água purificada, a luz será desviada e não entrará na objetiva. Neste caso, ao observarmos pela ocular, o campo aparecerá totalmente escuro.

Contudo, se a lâmina contiver algum objeto com índice de refração diferente do meio, haverá uma dispersão da luz por reflexão e refração, fazendo com que a luz incida sobre o objeto e entre na objetiva. Neste caso, ao observarmos pela ocular, o objeto aparecerá iluminado e o fundo escuro.

O condensador que a microscopia de campo escuro utiliza se chama condensador cardióide e pode ser de dois tipos: seco e úmido. O tipo úmido exige um meio líquido entre a objetiva e a lâmina, ao passo que o tipo seco não precisa. O tipo úmido fornece imagens mais nítidas, ao contrário do tipo seco. Por essa razão, o tipo mais utilizado é o tipo úmido e o líquido utilizado entre a lâmina e a objetiva é o óleo de imersão.

A microscopia de campo escuro é útil quando precisamos analisar células, componentes ou microrganismos não corados. Um exemplo de aplicação é a observação de bactérias que não podem ser coradas adequadamente por meios convencionais, como a Borrelia burgdorferi, que infecta um tipo de carrapato e causa a doença de Lyme em humanos.

Fique atento para o próximo artigo: microscopia ultra-violeta.

Microbiologia Online com Foco em: Teoria e Aplicação da Microscopia Luminosa (Parte III)

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Fri, 27 Nov 2009 00:07:00 +0000

A microscopia luminosa é a técnica de microscopia mais amplamente utilizada em laboratórios de microbiologia. Na microscopia luminosa, ou óptica, os objetos a serem estudados aparecem escuros e a área observada se apresenta bem iluminada. O poder de aumento de um microscópio óptico é de no máximo 2000 vezes. A dificuldade principal em microscopia luminosa é obter um grande poder de aumento, sem prejuízo da nitidez e definição da imagem.

Em microscopia luminosa, o poder de resolução representa o tamanho do menor objeto que pode ser visto ao microscópio com total nitidez. Um bom microscópio deve combinar poder de aumento com poder de resolução, caso contrário, uma imagem poderia ser ampliada 2000 vezes, mas apareceria distorcida e sem definição.

Quanto menor o poder de resolução, menor o tamanho do objeto que o microscópio consegue definir. Assim, um microscópio luminoso com um poder de resolução de 0,5 µm consegue ampliar, com nitidez, objetos maiores ou iguais a 0,5 µm.

Para calcular o poder de resolução de um microscópio óptico, precisamos conhecer:

O comprimento de onda da luz utilizada
A abertura numérica da objetiva
A abertura numérica do condensador.

O comprimento de onda da luz visível é conhecido e varia entre 400 e 700 nm, ou 0,4 a 0,7 µm.

Em microscopia luminosa, a abertura numérica (AN) é calculada pela fórmula:

AN = n sen θ, onde

n= índice de refração do meio. n=1,56 quando se utiliza óleo de imersão e n=1 quando não se utiliza óleo de imersão.

θ = metade do ângulo do cone de luz que entra na objetiva ou condensador. Ver figura abaixo.

Nos microscópios luminosos mais modernos, a AN da objetiva e do condensador é indicada no manual do equipamento.

Finalmente, o poder de resolução é calculado pela equação:

Em laboratórios de microbiologia, geralmente a técnica de microscopia luminosa é realizada com óleo de imersão. O óleo de imersão possui um índice de refração maior que o ar, aumentando a AN e reduzindo o poder de resolução, o que na prática possibilita a observação de objetos menores, como células e bactérias, por exemplo.

Este artigo foi útil para você? Deixe suas dúvidas e comentários e fique atento para o próximo artigo: microscopia de campo escuro.

Microbiologia Online com Foco em: Partes e Funções de um Microscópio Luminoso (Parte II)

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Wed, 25 Nov 2009 22:45:00 +0000

Um microscópio primitivo foi inventado em 1590, em Middelburg, Holanda, pelos construtores de lentes Hans Lippershey, Zacharias Jansen e seu pai Hans Jansen. Posteriormente, Galileo Galilei aprimorou o instrumento utilizando um conjunto de lentes alinhadas e o chamou de “occhiolino”, que significa “pequeno olho” em italiano. Em 1625, Giovanni Faber nomeou o “occhiolino” de Galileo Galilei de um microscópio composto e este nome permanece até hoje.

O microscópio óptico, o tipo mais comum de microscópio, contém várias partes com funções específicas. Observe a figura e descubra suas funções.

Oculares: contêm as lentes oculares, as quais fornecem um poder de aumento de 10x a 15x, geralmente. É por aqui que você olha através.
Revólver: segura as lentes objetivas e pode ser girada facilmente para mudar o aumento.
Lentes objetivas: geralmente, há três ou quatro lentes objetivas em um microscópio, consistindo de poderes de aumento de 4x, 10x, 40x e 100x. A fim de obter o aumento total de uma imagem, você precisa multiplicar o aumento das lentes oculares pelo aumento das lentes objetivas. Portanto, se você utilizar em conjunto uma lente ocular de 10x com uma lente objetiva de 40x, o aumento total é de 10 x 40 = 400 vezes.
Presilhas: seguram a lâmina no lugar.
Platina: é uma plataforma plana que suporta a lâmina sendo analisada.
Diafragma: controla a intensidade e o tamanho do cone de luz projetado sobre o espécime. Como uma regra geral, quanto mais transparente o espécime, menos luz é requerida.
Fonte de luz: projeta luz para cima através do diafragma, lâmina e lentes.
Base: suporta o microscópio.
Condensador: ajuda a focar a luz sobre a amostra analisada. É particularmente útil quando utilizado em conjunto com as lentes objetivas mais poderosas.
Braço: suporta o microscópio quando carregado.
Botão macrométrico: quando o botão é girado, a platina é movida para cima ou para baixo, a fim de promover um ajuste grosso de foco.
Botão micrométrico: utilizado para um ajuste fino de foco.

Próximo artigo: teoria e aplicação da microscopia luminosa.

Microbiologia Online com Foco em: Princípios dos Microscópios e Microscopia (Parte I)

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Wed, 25 Nov 2009 22:41:00 +0000

O microscópio é talvez o equipamento mais comum em qualquer laboratório de microbiologia, uma vez que ele permite aos alunos e profissionais examinarem microrganismos e estruturas invisíveis a olho nu. Há microscópios com vários níveis de aumento, desde centenas até milhares de centenas de diâmetro. Claro, o preço de um microscópio aumenta com sua qualidade, mas mesmo o microscópio mais simples pode fornecer imagens incríveis do mundo da microbiologia.

Cada tipo de microscópio e cada técnica de preparação de materiais oferecem algumas vantagens especificas sobre a demonstração de certos elementos morfológicos. Nesta serie de artigos, nós vamos aprender os princípios e tipos de microscópios, assim como alguns dos métodos microbiológicos utilizados para observar as dimensões, as formas e características estruturais dos microrganismos.

Os microscópios caem em duas categorias: luminosa (ou óptica) e eletrônica, dependendo do princípio ou método de aumento empregado. Na microscopia luminosa, o aumento é obtido através de um sistema de lentes ópticas, ao passo que na microscopia eletrônica um feixe de elétrons é utilizado para produzir a imagem ampliada.

A microscopia luminosa pode ser dividida em seis subcategorias: microscopia de campo claro, microscopia de campo escuro, microscopia ultravioleta, microscopia de fluorescência, microscopia de contraste de fases e contraste de interferência diferencial (CID). Iniciantes irão muito provavelmente utilizar a microscopia de campo claro para examinar suas amostras, uma vez que esta é a técnica mais comum empregada em pesquisa e laboratórios de controle de qualidade. Contudo, é muito importante conhecer as outras aplicações, pois cada uma possui uma propriedade única que a torna especialmente desejável para a demonstração de estruturas morfológicas específicas.

Próximo artigo: partes e funções de um microscópio luminoso.

Microbiologia Online com Foco em: a proteína M5 de Streptococcus pyogenes é essencial para a virulência

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Wed, 25 Nov 2009 22:38:00 +0000

Streptococcus pyogenes (estreptococos do grupo A) é um dos principais patógenos restritos aos seres humanos. Ele possui uma proteína M ancora à superfície que é essencial para a virulência e colonização, por inibir a fagocitose ex vivo. Como pouca coisa é conhecida sobre o papel da proteína M de Streptococcus pyogenes in vivo, Waldemarsson et al analisaram a contribuição de diferentes regiões da proteína M para a virulência, utilizando a proteína M5 ligadora ao fibrinogênio (Fg) e um modelo de camundongos com infecção invasiva aguda. A proteína M5 de Streptococcus pyogenes pode ser dividida em três regiões distintas: a região hiper-variável N-terminal (HVR), a região B-repetitiva e a região C-repetitiva.

Em uma primeira etapa, camundongos foram infectados com o tipo selvagem de Streptococcus pyogenes, contendo a proteína M5 intacta, ou com um mutante faltando a proteína M5 inteira; os resultados demonstraram que todos os camundongos infectados com a cepa selvagem de Streptococcus pyogenes sucumbiram à infecção, ao passo que todos os camundongos infectados com as cepas mutantes sobreviveram.

Em uma segunda etapa, os camundongos foram infectados com cepas mutantes de Streptococcus pyogenes e os resultados mostraram claramente que os mutantes sem a região HVR ou a B-repetitiva tiveram a infecção fortemente atenuada, enquanto um mutante de Streptococcus pyogenes sem a região conservada C-repetitiva teve a infecção apenas levemente atenuada.

Porque a região HVR da proteína M5 de Streptococcus pyogenes não é necessária para a resistência à fagocitose, os dados indicam que a região HVR desempenha um importante, mas desconhecido papel durante a infecção aguda. A região B-repetitiva do Streptococcus pyogenes é necessária para a resistência à fagocitose e especificamente se liga ao Fg, sugerindo que ela promove a virulência se ligando ao Fg.

De acordo com Waldemarsson et al, “estes dados demonstram que duas regiões distintas da M5, incluindo a HVR, são essenciais para a virulência durante os estágios iniciais de uma infecção. Em particular, nossos dados fornecem a primeira evidência in vivo que a HVR de uma proteína M desempenha um papel principal na virulência, focando interesse no papel molecular desta região”.

Microbiologia Online com Foco em: características do Staphylococcus aureus

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Wed, 25 Nov 2009 22:30:00 +0000

Apenas duas de três espécies do gênero Staphylococcus, S. aureus e S. epidermidis, têm importância médica. Staphylococcus aureus é a espécie patogênica, ao passo que Staphylococcus epidermidis raramente causa infecções humanas, sendo um patógeno oportunista em pessoas com sistema imune comprometido.

Resistência

Staphylococcus são um dos cocos não formadores de esporos mais resistentes. Alguns podem suportar uma temperatura de 60 ºC por 30 minutos e o contato com uma solução de fenol 1% por 15 minutos. Eles permanecem como células viáveis quando refrigerados ou até mesmo dessecados por até vários meses. A maioria das amostras de Staphylococcus aureus cresce na presença de altas concentrações de cloreto de sódio (10 a 15%) e resistem à ação dos sais biliares.

Há muito tempo atrás, os Staphylococcus eram sensíveis à penicilina, porém mais recentemente, o desenvolvimento de cepas resistentes a antibióticos tem causado um problema sério de saúde pública. Em geral, as cepas predominantes são sensíveis a antibióticos, mas há um número crescente de cepas resistentes a antibióticos em hospitais. Cerca de 80% dos Staphylococcus isolados de pacientes infectados em hospitais são resistentes à penicilina, estreptomicina, tetraciclina, oxacilina e até mesmo meticilina. De fato, Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA, do inglês Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), Staphylococcus aureus Resistente à Oxacilina (ORSA, do inglês Oxacillin- Resistant Staphylococcus aureus) e Staphylococcus aureus que são resistentes a vários antibióticos ou Staphylococcus aureus multi-resistentes são denominados super germes.

Produtos Metabólicos

O Staphylococcus aureus produz várias toxinas filtráveis quando cultivado em condições apropriadas, especialmente em uma atmosfera rica em CO2. As diferentes toxinas produzidas são discutidas nos próximos parágrafos.

Alfa (α)-hemolisina: é altamente ativa contra hemácias de coelhos, causando lise a 37 ºC. É moderadamente ativa contra hemácias de carneiros e inativa contra hemácias humanas. Uma vez que praticamente todas as amostras de Staphylococcus aureus, recentemente isoladas de infecções humanas produzem α-hemolisina, a síntese desta enzima é uma forte sugestão de patogenicidade, embora não seja conclusiva para fins de identificação porque os Streptococcus também produzem esta enzima.

Beta (β)-hemolisina: ela age nas hemácias de carneiros, de gado e de seres humanos, mas não nas de coelhos. Esta enzima é muito menos tóxica que a α-hemolisina para animais de laboratório e é produzida tanto em condições aeróbicas quanto anaeróbicas.

Gama (γ) e Delta (δ)-hemolisina: elas são isoladas e identificadas como produtos metabólicos de Staphylococcus, mas suas reações são bem diferentes das anteriores. Elas não são tão bem conhecidas quanto as α e β-hemolisinas.

Leucocidina: outro produto filtrável de Staphylococcus, conhecida por sua ação destrutiva contra leucócitos.

Coagulase: é sintetizada por Staphylococcus aureus e não por Staphylococcus epidermidis. Por esta razão, o teste de coagulase é frequentemente utilizado como método de identificação bacteriana a fim de diferenciar S. aureus de Staphylococcus Coagulase Negativos (SCN). Hoje em dia, os SCN representam os agentes mais comuns de infecções clínicas, junto com S. aureus. Os Staphylococcus produzem uma pró-coagulase que reage com um co-fator em plasma citratados ou oxalatados de coelhos ou seres humanos, resultando em um agente enzimático ativo responsável pela coagulação plasmática. A produção de coagulase é facilmente demonstrável pela mistura de uma suspensão de Staphylococcus aureus com plasma diluído.

Fibrinolisina: é outro fator produzido por algumas amostras de S. aureus, causando a digestão de fibrina humana, de cachorros, de ratos e de carneiros.

Microbiologia Online com Foco em: Teste de Esterilidade Rápido? Em 90 min?

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Wed, 25 Nov 2009 22:13:00 +0000

Uma aplicação recente aprovada pela FDA permite aos microbiologistas realizarem testes de esterilidade rápidos, obtendo resultados rápidos em 90 minutos. Isto representa um imenso avanço no campo da microbiologia, uma vez que os testes de esterilidade tradicionais demoram 14 dias para serem concluídos. O sistema Scan RDI Analyzer é um controle microbiano ultra-rápido de produtos filtráveis, o que significa que além do teste de esterilidade rápido, é possível analisar água, bioburden, produtos não estéreis, monitoramento ambiental, etc.

O sistema tem uma sensibilidade muito alta, até 1 célula por amostra. É possível realizar um teste de esterilidade rápido em sua amostra se a contagem total teórica for menor que 105 células de bactérias e 104 células de leveduras ou bolores.

O sistema Scan RDI Analyzer torna o teste de esterilidade rápido uma realidade por detectar e contar diretamente células de bactérias, leveduras e bolores, sem a necessidade de multiplicação celular. Para fazer isso, ele faz uso de duas tecnologias: marcação celular fluorescente e varredura a laser, e é também chamado de Citometria de Fase Sólida.

Procedimento para Teste de Esterilidade Rápido

Filtrar amostras através de uma membrana de 0,4 µm de porosidade. Os microrganismos são retidos.
Transferir a membrana para um “pad” absorvente saturado com um reagente de ativação por 60 minutos.
Marcar as amostras com um reagente específico, por 30 minutos.
Transferir a membrana para o analisador, o qual utiliza uma varredura a laser em alta velocidade para varrer toda a superfície da membrana em 3 minutos.

Os reagentes específicos empregados para marcação celular fazem uso de clivagem enzimática de um substrato não fluorescente para liberar fluorocromo livre no citoplasma. Somente células viáveis, com membrana celular intacta, são capazes de reter a sonda fluorescente, o que representa um avanço significativo se comparado com as técnicas de ATP, por exemplo.

Os sinais originados do sistema são expressos como parâmetros de discriminação na tela, permitindo ao equipamento de teste de esterilidade rápido diferenciar entre bactérias marcadas e sinais de interferência, como partículas eletrônicas, ópticas ou não fluorescentes. Uma vez que todo o teste de esterilidade rápido não é destrutivo, é possível usar um microscópio para checar e confirmar se a célula marcada é de fato um microrganismo e não de qualquer outra partícula orgânica.

Alguns estudos já mostraram que o teste de esterilidade rápido com Scan RDI é confiável, uma vez que ele detecta e conta todos os microrganismos viáveis em uma amostra, incluindo esporos, anaeróbios, estressados ou fastidiosos. Além disso, o sistema é também capaz de realizar identificação bacteriana de Escherichia coli, Legionella pneumophila e também identifica Cryptosporidium e Giardia.

Se você quiser saber mais, por favor visite o site oficial ou faça o download deste artigo.

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Microbiologia Online com Foco em: Como Realizar Identificação Bacteriana por Cromatografia Gasosa de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos?

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Sat, 21 Nov 2009 19:52:00 +0000

Como afirmado em meu artigo anterior “A Importância da Identificação Bacteriana em Salas Limpas”, nós devemos identificar a microbiota obtida de amostras ambientais, e isto não está limitado aos ambientes de salas limpas. Neste artigo, eu vou focar na identificação de bactérias somente.

Há vários métodos de identificação bacteriana disponíveis, os quais podem ser classificados em dois grandes grupos: o grupo fenotípico e o grupo genotípico. O grupo fenotípico inclui:

Testes bioquímicos
Biotipagem
Sorotipagem
Fagotipagem
Suscetibilidade antimicrobiana
Eletroforese Enzimática Multi-Local, do inglês Multi-Locus Enzyme Electrophoresis (MLEE)
Tipagem eletroforética de proteínas e imuno-blotting
Cromatografia Gasosa de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos

O grupo genotípico inclui:

Tipagem de plasmídeos
Análise de Enzimas de Restrição, do inglês Restriction Enzyme Analysis (REA)
Eletroforese em Gel por Campo Pulsado, do inglês Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Ribotipagem
Análise de DNA polimórfico Amplificado Aleatoriamente
Rep-PCR
PCR-ribotipagem

O único sistema de cromatografia gasosa (CG) disponível comercialmente dedicado à identificação bacteriana por análise de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos (FAME, do inglês Fatty Acid Methyl Ester) é o Sistema de Identificação Microbiana (SIM) Sherlock, desenvolvido pela Microbial ID, Inc. (MIDI). O banco de dados original para identificação de bactérias aeróbicas foi desenvolvido por M. Sasser, em 1990.

O princípio do método FAME se baseia no conceito de que alguns microrganismos possuem composições típicas de ácidos graxos celulares, os quais podem ser comparados à composição típica de ácidos graxos das cepas usadas para criar a biblioteca. Após comparação, as identificações dos microrganismos desconhecidos são determinadas.

Por muitos anos, a análise de ácidos graxos de cadeia curta (ácidos graxos voláteis, AGVs) tem sido rotineiramente utilizada na identificação de bactérias anaeróbicas. Em vários artigos científicos, os ácidos graxos entre 9 e 20 carbonos também têm sido usados para identificação bacteriana, especialmente microrganismos Gram negativos não fermentadores. Com o advento das colunas capilares de sílica fundida (que permite a recuperação de hidróxi ácidos e a resolução de muitos isômeros), se tornou prático e mais fácil utilizar CG de ésteres metílicos de ácidos graxos de células íntegras para identificar culturas microbianas puras e isoladas, bactérias de importância médica e em estudos taxonômicos.

O método FAME utiliza um procedimento específico de preparação de amostra e um sistema cromatográfico sofisticado para fornecer perfis de composição de ácidos graxos reprodutíveis qualitativamente e quantitativamente.

Procedimento de Preparação da Amostra

As bactérias selecionadas para identificação por FAME são repicadas duas vezes em Trypticase Soy Broth solidificado com 1,5% de Agar e então incubadas aerobicamente a 28 ºC por 24 h. O crescimento é examinado quanto à presença de culturas puras e submetido à extração de ácidos graxos em cinco etapas básicas e simples, resumidas na figura abaixo.

Reagente 1:NaOH P.A. em Metanol HPLC
Reagente 2: HCl 6,0 N P.A. em Metanol HPLC
Reagente 3: hexano HPLC em metil-terc-butil-éter HPLC
Reagente 4: solução aquosa de NaOH P.A.

Todas as vidrarias devem ser novas e somente Teflon e vidro deve entrar em contato com os reagentes.

Sistema Cromatográfico

O reconhecimento de perfis de ácidos graxos é realizado utilizando o sistema SIM junto com uma biblioteca padrão. O SIM consiste de um cromatógrafo gasoso equipado com uma coluna capilar de sílica fundida, um detector de ionização de chamas, um integrador e um amostrador automático acoplado com um sistema computadorizado. O software Sherlock automaticamente ajusta os parâmetros operacionais do cromatógrafo gasoso cada vez que uma amostra é processada. Os ácidos graxos são separados devido aos diferentes tempos de retenção, utilizando ar sintético, gás hidrogênio como carreador e gás nitrogênio como gás de compensação (“make up”).

Acoplado ao Sherlock está o software ChemStation utilizado para efetuar amostragens, análises e integração das amostras cromatográficas. As porcentagens cromatográficas são automaticamente calculadas e após comparação com a biblioteca padrão MIDI, as identificações bacterianas são expressas como gênero, espécie e sub-espécie.

Se você quiser saber mais sobre identificação bacteriana por cromatografia gasosa, eu recomendo a leitura deste livro ou visitar o site oficial.

Microbiologia Online com Foco em: por que Probióticos são Importantes para o Organismo?

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Sat, 21 Nov 2009 19:38:00 +0000

O termo “probióticos” deriva do grego e foi primeiramente introduzido em 1953 por Kollath. Em oposição aos “antibióticos”, probióticos significa “a favor da vida” e foi inicialmente definido como organismos vivos que afetam beneficamente o hospedeiro animal melhorando o equilíbrio microbiano intestinal. Hoje, os probióticos são considerados suplementos dietéticos de microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades apropriadas, conferem potenciais benefícios à saúde do hospedeiro, não somente no intestino.

Para que um microrganismo seja considerado um probiótico, a bactéria deve ser: não patogênico, aderir às células intestinais, estável no suco gástrico e bile, capaz de se reproduzir, produzir ácidos, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas anti-patógenas. Os tipos mais comuns de microrganismos utilizados como probióticos são os Lactobacillus e Bifidobacterium.

As espécies mais comuns de probióticos são:

Lactobacillus acidophilus, especialmente
Lactobacillus casei
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus reuterii
Enterococus faecium
Bifidobacterium adolescentis
Bifidobacterium breve
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium infantis
Bifidobacterium longum

Pesquisas recentes sugerem vários benefícios potenciais das terapias probióticas, incluindo, mas não limitado a:

Re-estabelecimento da microbiota normal intestinal
Melhoria da taxa de absorção de cálcio e minerais de ferro
Gerenciamento da intolerância à lactose
Prevenção do câncer de colo
Melhoria de alguns sintomas de intestino irritável e colite
Redução de inflamação
Melhoria da função imune e prevenção de infecções.

Assim como os microrganismos, os probióticos são termo-sensíveis e têm uma validade muito curta. Esta é a razão pela qual eles devem ser mantidos refrigerados. Exemplos de alimentos probióticos incluem leite fermentado, iogurte, pó ou cápsulas.

Geralmente, probióticos são seguros e até mesmo recomendados pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Efeitos adversos foram relatados somente pelo consumo de probióticos por pacientes que já estavam muito doentes, com pancreatite aguda ou, por qualquer outra razão, com o sistema imune deficiente.

Microbiologia Online com Foco em: Antioxidantes são o Calcanhar de Aquiles do vírus Influenza H1N1

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Sat, 21 Nov 2009 19:32:00 +0000

Um artigo recente publicado no FASEB Journal mostrou que os antioxidantes, amplamente encontrados em alimentos vegetais, pode ser o calcanhar de Aquiles do vírus Influenza H1N1, prevenindo que o vírus H1N1 invada e colonize nossos pulmões. Além disso, a pesquisa conduzida por Sadis Matalon e colegas mostrou que os antioxidantes podem ajudar no tratamento do vírus Influenza H1N1.

Os pesquisadores descobriram que o vírus H1N1 contém uma proteína chamada M2, que destrói ou danifica as células epiteliais de nossos pulmões removendo líquido do interior, promovendo os estágios iniciais da pneumonia e outros problemas pulmonares.

A fim de fazer esta descoberta, eles conduziram o experimento em três etapas. Primeiro, eles injetaram somente a proteína pulmonar dentro de ovos de rã e mediram sua função. Segundo, eles injetaram a proteína M2 do vírus H1N1 junto com a proteína pulmonar dentro de ovos de rã e descobriram que a proteína M2 do vírus H1N1 fez com que a função da proteína pulmonar diminuísse significativamente. Por meios de técnicas de biologia molecular, os cientistas isolaram o segmento da proteína M2 do vírus H1N1 responsável por danificar a proteína pulmonar e puderam demonstrar que, sem este segmento, o vírus H1N1 foi incapaz de danificar a proteína pulmonar. Terceiro, uma proteína M2 intacta do vírus H1N1 e a proteína pulmonar foram então injetadas novamente em ovos de rã junto com drogas antioxidantes. Isto também impediu que a proteína M2 do vírus H1N1 danificasse a proteína pulmonar. Quando estes experimentos foram repetidos usando células pulmonares humanas, os resultados foram exatamente os mesmos.

“Embora as vacinas ainda permaneçam como a primeira linha de intervenção contra a gripe por um longo tempo, este estudo abre as portas para tratamentos inteiramente novos destinados a parar o vírus depois que a pessoa esteja doente”, disse Gerald Weissmann, M.D., editor-chefe do FASEB Journal, “e à medida que o Dia de Ação de Graças se aproxima, a descoberta se torna outra razão para beber vinho tinto para sua saúde”.

Microbiologia Online com Foco em: Dia Mundial de Lavagem das Mãos

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Tue, 27 Oct 2009 23:21:00 +0000

O Dia Mundial de Lavagem das Mãos se iniciou em 15 de Outubro de 2009, mas não deve ser limitado àquele dia. Este Dia de Lavagem das Mãos é uma campanha internacional, trazida até você pela Academia para o Desenvolvimento Educacional, CDC, UNICEF e vários outros parceiros. De acordo com www.globalhandwashingday.org: “O desafio é transformar a lavagem das mãos com sabão de uma abstrata boa idéia em um comportamento automático realizado nas casas, escolas e comunidades do mundo todo. Transformar a lavagem das mãos com sabão antes das refeições e depois de usar o banheiro em um hábito enraizado poderia salvar mais vidas que qualquer vacina ou intervenção médica, reduzindo mortes por diarréia pela metade e mortes por infecções respiratórias agudas em um quarto. Uma vasta mudança no comportamento de lavagem das mãos é crítica para atingir o Objetivo de Desenvolvimento do Milênio de reduzir o número de mortes entre as crianças abaixo de cinco anos de idade em dois terços até 2015”.

Uma pesquisa Americana conduzida em 2007 mostrou que enquanto nove entre dez (92%) de americanos disseram que sempre lavaram suas mãos depois de usarem um banheiro público, uma pesquisa observacional em 5 cidades mostrou que o número real está mais para 3 entre 4 (77%).

Lavar as mãos com sabão é a maneira mais eficiente e barata de prevenir diarréia e infecções respiratórias agudas, que levam as vidas de milhões de crianças em países subdesenvolvidos a cada ano. Juntas, são responsáveis pela maioria das mortes infantis. Mesmo assim, a despeito de seu potencial de salvar vidas, a atividade de lavar as mãos com sabão é raramente praticada e difícil de promover.

Lavar as mãos é fácil, aprenda como. Faça o download deste Cartaz sobre Higienização das Mãos, fornecido pela ANVISA.

Convencido sobre a importância de lavar as mãos? Assista o vídeo passo a passo para higienização das mãos.

Microbiologia Online com Foco em: A Importância da Identificação Bacteriana em Salas Limpas

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Tue, 27 Oct 2009 22:26:00 +0000

Um programa abrangente de monitoramento ambiental de salas limpas deve incluir o monitoramento rotineiro tanto de partículas viáveis como não viáveis. Embora não haja exigência para a identificação bacteriana de todos os contaminantes presentes nestes ambientes controlados, um programa de controle ambiental deve incluir um nível apropriado de identificação de bactérias obtidas a partir de amostragem. Há vários métodos de identificação bacteriana disponíveis.

A primeira etapa para uma correta identificação bacteriana, especialmente em relação a um isolado de sala limpa, é a coloração de Gram, uma vez que ela pode fornecer pistas elucidativas sobre a fonte da contaminação microbiana. Se a identificação bacteriana dos isolados revelar cocos Gram positivos, a fonte de contaminação pode ser derivada do pessoal. Se a identificação bacteriana dos isolados revelar bacilos Gram positivos, a fonte de contaminação pode ser derivada de poeira ou cepas resistentes a desinfetantes. Se a identificação bacteriana dos isolados revelar bacilos Gram negativos, a fonte de contaminação pode ser derivada da água ou qualquer superfície úmida.

A identificação bacteriana em salas limpas farmacêuticas é exigida por diversas razões associadas à garantia da qualidade: determinação de microrganismos do ambiente de manufatura; identificação bacteriana na análise do produto final; demonstrar ausência de certos microrganismos em produtos não estéreis e água; controle de qualidade de estoques de fermentação em biotecnologia; confirmação de microrganismos-teste em processos de validação. Cada vez mais a Food and Drug Administration (FDA) espera que a identificação bacteriana possa ajudar na determinação da microbiota usual de uma planta específica, para avaliar a eficiência da limpeza e investigar a fonte de contaminação, requerida quando limites de ação corretiva são excedidos ou testes de esterilidade se tornam contaminados.

Microbiologia Online com Foco em: O Que é Biofilme?

noreply@blogger.com (Fabio Pacheco) — Tue, 27 Oct 2009 22:05:00 +0000

Tecnicamente, biofilmes são uma conglomeração de bactérias, fungos, algas, protozoários, resíduos ou produtos de corrosão aderidos em uma matriz auto-produzida e secretada de Substâncias Poliméricas Extracelulares (SPE). A SPE pode ser composta de polissacarídeos, proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos. Essencialmente, um biofilme pode se formar quando bactérias aderem a superfícies em ambientes aquosos e começam a excretar SPE, uma substância pegajosa e grudenta que pode ancorá-las a todos os tipos de materiais, tais como metais, plásticos, partículas de solo, materiais de implantes médicos e tecidos. Uma vez ancoradas à uma superfície, os microrganismos do biofilme carregam uma variedade de reações prejudiciais ou benéficas (para os padrões humanos), dependendo das condições ambientais circundantes. Um exemplo de reação benéfica é a aplicação de biofilme para degradar cloreto de vinila, um solvente tóxico que pode contaminar o lençol freático e colocar em risco os recursos de água potável.

O biofilme funciona como uma barreira hidratada protetora entre as células bacterianas e seu ambiente. Ele facilita a sobrevivência sob condições adversas e insultos ambientais tais como radiação ultravioleta, estresses físico-químicos, dessecação e suprimento insuficiente de recursos nutritivos. Por estas razões, na natureza a maioria dos micróbios vive como comunidades em biofilmes.

Por outro lado, uma vez que as bactérias em biofilmes são mais resistentes a antibióticos, a formação de biofilmes em dispositivos médicos invasivos e tecidos danificados, tais como cateteres, articulações prostéticas e válvulas cardíacas é uma constante preocupação médica. Para a indústria, os biofilmes custam bilhões de dólares por ano em equipamentos danificados, contaminação de produtos e perdas energéticas. O fenômeno do biofilme impacta uma ampla gama de indústrias, incluindo a indústria do petróleo, de especialidades químicas, da saúde, de produtos domésticos, de água potável, mineração e utilidades.