แต่สุดท้ายก็เขียนเรื่องนี้ขึ้นมา เพื่อคอยเตือนสติตัวเองว่ากำลังทำ(lab)อะไรอยู่

จากชื่อโพสต์…ใช่แล้ว เรากำลังศึกษาเกี่ยวกับ efflux pump inhibitor

สารตัวหนึ่งออกฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบได้ดี รวมถึง Acinetobacter baumannii ด้ว

เราตั้งสมมติฐานว่าน่าจะออกฤทธิ์ ยับยั้งการทำงานของ efflux pump ในแบคทีเรีย

ตอนนี้กำลังทดสอบเพื่อยืนยันว่ามันมีคุณสมบัติเป็น efflux pump inhibitor

ขออ้างอิง การทดสอบ efflux pump inhibitor ตาม review article ของ Venter H. et al  ดังนี้

1. สารนั้นช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพในกรณีที่เชื้อดื้อยาดังกล่าวด้วยการแสดงออกของ efflux pump: ทดสอบโดยการทำ checkerboard (เราทำแล้ว)
2. สารนั้นไม่มีผลต่อเชื้อสายพันธุ์ที่ไม่มี efflux pump gene: ทดสอบด้วยการ delete efflux pump gene ออกไป และ สารนั้นต้องไม่มีผลกับเชื้อดังกล่าว (อันนี้ยังไม่ได้ทำ)
3. สารนั้นต้องไม่ทำให้ค่า MIC ของยาต้านจุลชีพ(ที่ไม่ได้ดื้อด้วยกลไก efflux pump) ลดลง
4. สารนั้นช่วยเพิ่มการสะสม (accumulation) และลดการปล่อย (extrusion) สารที่เป็น substrate ของ efflux pump: ทดสอบด้วย accumulation assay (อันนี้ก็ยังไม่ได้ทำ)
5. สารนั้นต้องไม่ permeabilise outer membrane ของเชื้อ
6. สารนั้นต้องไม่มีผลต่อ proton gradient ข้ามระหว่าง inner membrane

จริงๆแล้ว เราไม่ได้วางแผนที่จะทดสอบตามนี้ทุกประการ แต่จะดูผลการแสดงออกของ efflux pump gene ที่เราสนใจ ในสภาวะที่มีสารดังกล่าว ร่วมกับสารที่เป็น substrate ของ efflux pump นั้นเลย ด้วยวิธี qRT-PCR แต่ก็นั่นแหละ ยังไม่ถึงไหนเลย

ว่าแล้วก็ไปทำแลบกันต่อเถอะ

ที่มา: Front Microbiol. 2015 Apr 28;6:377. doi: 10.3389/fmicb.2015.00377. eCollection 2015.

Krahn T. และคณะผู้วิจัยพบเชื้อ A.baumannii R2090 จากประเทศอียิปต์ที่มียีน blaNDM อยู่บนโครโมโซม และพบว่าเชื้อมีความสัมพันธ์ใกล้เคียงกับ A.baumannii D1279779 จากประเทศออสเตรเลีย แต่ไม่มียีน blaNDM และไม่ดื้อยากลุ่ม carbapenems

Transposon Tn125 ที่มียีน blaNDM

และเมื่อนำเชื้อ A.baumannii R2090 mating กับเชื้อ A.baumannii CIP70.10  ที่ไม่ดื้อยากลุ่ม carbapenems และไม่มียีน blaNDM ก็พบว่าได้เชื้อ A.baumannii สายพันธุ์ดื้อยากลุ่ม carbapenems R2091 และพบว่าในโครโมโซมของเชื้อ มีชิ้นส่วนของ transposon Tn125 ที่มี  blaNDM อยู่ด้วย จากผลดังกล่าวแสดงให้เห็นว่า ยีน  blaNDM ที่อยู่ใน Tn125 บนโครโมโซมของสายพันธุ์ R2090 สามารถถ่ายทอดไปยังเชื้อ A.baumannii สายพันธุ์อื่นได้ แต่เชื้อใช้วิธีใดในการถ่ายทอดเพราะยีนอยู่บนโครโมโซม

แนวนางการถ่ายทอดยีนมีดังนี้ 1. conjugation 2. ส่งผ่าน outer membrane vesicle 3. tranformation และ 4. transduction โดยใช้ phage

สำหรับกรณีนี้ไม่น่าจะเป็น conjugation เนื่องจากเชื้อ A.baumannii R2090 ไม่มี plasmid และ ยีน blaNDM ก็อยู่บนโครโมโซม

เมื่อมาดูที่โครโมโซมของเชื้อ A.baumannii R2090 มีกลุ่มยีนที่ใช้ในการสร้าง prophage 3 ตำแหน่งโดย2 ตำแหน่งน่าจะใช้สร้าง prophageที่สมบูรณ์ได้ ดังแสดงในภาพ

putative prophage บนโครโมโซมของ A.baumannii R2090

ถ้าเป็นจริงตามนั้นก็นับว่าเป็นครั้งแรกที่มีรายงานการถ่ายทอดยีน blaNDM ในเชื้อ A.baumannii ด้วยวิธี transduction ของ phage

Reference: Krahn T. et al., Intraspecies transfer of the chromosomally encodedAcinetobacter baumannii bla_NDM-1carbapenemase gene. Antimicrob. Agents Chemother, March 2016.

ซึ่งรายงานไว้ใน http://www.thelancet.com/pdfs/journals/laninf/PIIS1473-3099(15)00424-7.pdf

จากรายงานพบเชื้อ E.coli สายพันธุ์ที่แยกได้จากหมู และดื้อยา colistin โดยพบ plasmid ที่คาดว่ามียีนดื้อยา colistin อยู่ ซึ่งนับเป็นครั้งแรกที่มีการรายงานพบยีนดื้อยา colistin บน plasmid

โดยยีนดังกล่าวคือ MCR-1 มีขนาด 1,626 bp อยู่บนplasmidชื่อ pHNSHP45 เมื่อวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนพบว่าคล้ายกับโปรตีน phosphoethanolamine transferase (EptA) ซึ่งทำหน้าที่ยับยั้งการเติม phosphoethanolamine ให้กับ lipidA

นอกจากนี้ยังพบว่า pHNSHP45 plasmid สามารถส่งผ่านไปยัง E.coli ตัวอื่นด้วยวิธี conjugation และ ส่งผ่านไปยัง K.pneumoniae และ P.aeruginosa ได้ด้วยวิธี transformation โดยทำให้เชื้อที่ได้รับplasmid นั้นดื้อยา colistin ตามมา

pHNSHP45 plasmid carried mcr-1 gene

Reference: Liu YY et al., Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis. 2016

1. Penicillins: inhibit peptidoglycan synthesis by binding to penicillin binding proteins(PBPs)or transpeptidase

Action of penicillin

Mechanism of penicillin resistance: S.aureus produces beta-lactamase(penicillinase) enzyme to hydrolyze penicillin

Mechanism of penicillin resistance

2. Methicillins(Penicillinase-resistant penicillins): inhibit peptidoglycan synthesis by binding to PBPs with the presence of penicillinase

Action of methicillin

Mechanism of methicillin resistance: S.aureus produce unique PBP or PBP2A so methicillin can not bind to the target PBP

This S.aureus is called methicillin-resistant Staphylococcus aureus or MRSA.

Mechanism of methicillin resistance

3. Vancomycin: inhibit peptidoglycan precursors

Action of vancomycin

Mechanism of vancomycin resistance: produce thickened peptidoglycan to prevent vancomycin into the cells

Mechanism of vancomycin resistance

4. Teixobactin: inhibit peptidoglycan synthesis by binding to lipid II(peptidoglycan precursor) and lipid III(cell wall teichoic acid precursor)

Action of teixobactin

Mechanism of teixobactin: Not discovered yet

Limitation of teixobactin: intrinsic resistance to teixobactin in gram negative bacteria

Hopefully, teixobactin resistant S.aureus will not be happened.

Reference: A new drug for resistant bugs. and Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: a new model of antibiotic resistance

จึงมีความพยายามพัฒนาอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับคัดเลือกเชื้อ S.lugdunensis จากตัวอย่างหนองหรือแผล

Selective Staphylococcus lugdunensis(SSL) medium:

ส่วนประกอบในอาหารเลี้ยงเชื้อ 1 ลิตร

• Giolitti-Cantoni broth 54.2 g
• Sodium chloride 45 g
• L-ornithine monohydrochloride 10 g
• Agar 15 g
• Potassium nitrate 1 g
• Deferoxamine mesylate 0.1 g
• Uracil 0.01 g
• Pyridoxal hydrochloride 0.005 g
• Hemin 0.005 g
• Vitamin K1 0.0005 g
• Bromocresol purple 0.02 g
• Phenol red 0.01 g

หลักการคัดเลือกเชื้อ S.lugdunensis

เชื้อ  S.lugdunensis สร้างเอนไซม์ ornithine decarboxylase(ODC) ไปทำปฏิกิริยากับ L-ornithine ทำให้อาหารเป็นด่างมากขึ้น (pH เพิ่มขึ้น) ไปเปลี่ยนสี indicator ให้เป็นสีม่วง นอกจากนี้ยังมี NaCl ช่วยยับยั้งเชื้ออื่นที่ไม่ทนเกลือ(salt-intolerant bacteria) และมี deferoxamine mesylate ช่วยยับยั้งเชื้อ S.epidermidis ซึ่งบางสายพันธุ์สามารถสร้าง ODC ได้

SSL medium แสดงการเจริญของเชื้อ S.lugdunensis (ลูกศรสีดำ) และ S.aureus (ลูกศรสีขาว)

คุณสมบัติความเป็น selective medium: เมื่อเพาะเชื้อบน SSL medium ภาวะ anaerobic นาน 48 ชั่วโมง

S.lugdunensis : colony สีเทามีวงแหวนสีม่วง อาหารเลี้ยงเชื้อรอบๆ colony จะไม่มีสี

S.epidermidis : colony ขนาดเล็กมากเป็น pinpoint เพราะถูกยับยั้งการเจริญ และในบริเวณที่มีเชื้อเจริญเยอะจริงๆอาจจะเห็นอาหารรอบๆไม่มีสีได้ แต่จะไม่มีวงแหวนสีม่วง

Staphylococci อื่นๆ : colony มีขนาดใหญ่ประมาณ 2-3 mm แต่ไม่มีวงแหวนสีม่วง

Vibrio parahaemolyticus : เป็นเชื้อที่เจริญในภาวะ anaerobe และมีวงแหวนสีม่วง แต่สีของcolonyออกสีน้ำเงินเขียว ซึ่งต่างจาก S.lugdunensis ที่จะเป็นสีเทา

ความไว(sensitivity)ในการทดสอบกับตัวอย่างแผลหนองจากผู้ป่วย

SSL มีความไว 94.4% คือตรวจพบเชื้อ 34 ตัวอย่างจาก 36 ตัวอย่างที่มีเชื้อ S.lugdunensis ในขณะที่ routine plate (blood agar และ chocolate agar) มีความไวเพียง 19.4% คือตรวจพบเชื้อ 7 จาก 36 ตัวอย่างที่มีเชื้อ

Reference : Ho PL. et al. Novel selective medium for isolation of Staphylococcus lugdunensis from wound specimens. J Clin Microbiol, July 2014.

Sitafloxacin (Gracevit^®) : an oral fluoroquinolone antibiotic inhibit bacterial DNA replication. Its targets are DNA gyrase and topoisomerase. In vitro study, sitafloxacin showed broad spectrum activity against gram negative, gram positive, anaerobic bacteria, and atypical pathogen.

Oral sitafloxacin is approved in Japan for bacterial infections such as pneumonia, urethritis, and pyelonephritis. No Clinical Laboratory and Standards Institute(CLSI) breakpoints for sitafloxacin susceptibility, so breakpoints for other fluoroquinolones are applied for interpretation.

According to MIC90 of sitafloxacin(MIC of sitafloxacin can inhibit 90% of bacterial isolates) its efficiency was greater than levofloxacin, ciprofloxacin, moxifloxacin, and tosufloxacin.

MIC90 of sitafloxacin against many bacteria

Although, major mechanism of fluoroquinolone is mutation of targets(DNA gyrase: gyrA and gyrB, topoisomerase: parC and parE), sitafloxacin demonstrated activity against bacteria with drug-target mutation.

Surprisingly, sitafloxacin had effective activity against many superbugs including methicillin-resistant S.aureus(MRSA), methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci(MR-CNS), and carbapenem-resistant A.baumannii. 

In vivo studies demonstrated effective activity of sitafloxacin against polymicrobial infections in rat uterine endometritis model, S.pneumoniae in mouse lung infection model, and H.influenzae pneumonia in murine model.

In respiratory tract infection study, 50 mg of sitafloxacin twice daily showed 100% eradication rate of pathogens including S.pneumoniae, H.influenzae, M.pneumoniae, and P.aeruginosa.

For complicated urinary tract infection, sitafloxacin 100 mg twice daily for 7 days eradicated up to 96% of pathogens including E.faecalis, E.coli, P.aeruginosa, and K.pneumoniae.

Moreover, oral sitafloxacin also showed effective activity in otorhinolaryngological infections, urethritis, C.trachomatis-associated cervicitis, odontogenic infections, otitis media, and paranasal sinusitis.

Reference :

Keating GM. Sitafloxacin in bacterial infections. Drugs, April 2011.

blaOXA23 ในเชื้อ A. radioresistens

blaOXA51 ในเชื้อ A. baumannii

blaOXA134 ในเชื้อ A. lwoffii/A. schindleri

blaOXA211 ในเชื้อ A. johnsonii

blaOXA213 ในเชื้อ A. calcoaceticus

blaOXA214 ในเชื้อ A. haemolyticus

blaOXA228 ในเชื้อ A. bereziniae

Kamolvit และคณะได้ศึกษาวิธี multiplex PCR ต่อ blaOXA gene เพื่อแยกเชื้อระหว่าง A. lwoffii/A.schindleri, A. johnsonii, A. calcoaceticus, A. haemolyticus, และ A. bereziane โดยใช้ primer

Primer ที่ใช้ใน multiplex PCR

ผล multiplex PCR ที่ได้

ผล multiplex PCR เพื่อตรวจหา blaOXA gene

จากแยกเชื้อด้วยวิธี multiplex PCR ถือว่าได้ผลค่อนข้างเร็วและสามารถแยกเชื้อได้ในเบื้องต้น แต่ก็ต้องระวังว่า blaOXA gene ส่วนใหญ่มักจะอยู่บน mobile genetic element จึงสามารถเคลื่อนย้ายระหว่าง species ของเชื้อได้ เช่นกรณีของ blaOXA51 ที่เคยมีผู้เสนอว่าสามารถใช้แยกเชื้อ A.baumannii ได้ แต่ปัจจุบัน Acinetobacter species อื่นๆ ก็มีรายงานพบ blaOXA51 ได้ รวมถึง A.baumannii บางตัวก็ไม่พบ blaOXA51

Reference :

Kamolvit W, Higgins PG, Paterson D. et al. Multiplex PCR to detect the genes encoding naturally occurring oxacillinases in Acinetobacter spp..Journal of Antimicrobial Chemotherapy, November 2013.

MICs: Minimum Inhibitory Concentrations คือค่าความเข้มข้นของยาที่ต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้

MPCs: Mutant Prevention Concentrations คือค่าความเข้มข้นของยาที่ต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ resistant mutant subpopulation ได้

ดังนั้นค่า MPCs ≥ MICs และค่า MPC/MIC ratio จะได้ ≥ 1

ช่วงความเข้มข้นของยาระหว่าง MIC ถึง MPC เรียกว่า mutant selection window เป็นช่วงความเข้มข้นยาที่ทำให้เชื้อไวต่อยาไม่สามารถเจริญได้(เพราะถูกยับยั้งตั้งแต่ที่ความเข้มข้นเท่ากับ MIC) แต่จะมีเชื้อบางส่วนที่เจริญได้ซึ่งเรียกว่า resistant mutant subpopulation

ประโยชน์ของค่า MPC และ MPC/MIC ratio

• ทำให้ทราบความสามารถของยาในการป้องกันการเกิด mutation ของเชื้อทำให้เชื้อดื้อยา โดยดูจากค่า MPC/MIC ratio ค่ายิ่งต่ำยิ่งดี เพราะแสดงว่าที่ความเข้มข้นยาเท่ากับ MIC ก็สามารถป้องกันไม่ให้เชื้อ resistant mutant เจริญได้
• เป็นข้อมูลสำคัญในการทำนายผลการรักษา เพราะถ้าค่า MPC/MIC ratio สูงมาก แสดงว่าการรักษาด้วยยานั้นมีแนวโน้มที่จะทำให้เชื้อดื้อยา และรักษาไม่ได้ผล
• เป็นข้อมูลที่จะช่วยป้องกันไม่ให้เกิดเชื้อดื้อยาจากการรักษา
• เป็นประโยชน์ในการปรับขนาดของยาให้เหมาะสม
• เป็นประโยชน์ในการเลือกขนาดของยา(dose) ในกรณีที่เป็นยาใหม่(new compound)

วิธีการหาค่า MPC และ MPC/MIC ratio

1. ทดสอบหาค่า MIC ด้วยวิธี agar dilution

• เตรียม Mueller-Hinton agar(MHA) ผสมยาที่ต้องการทดสอบความเข้มข้น 0.015-256 ug/ml
• spot เชื้อที่ต้องการทดสอบ 10⁴ CFU incubate 35 ^oC 18-20 ชั่วโมง
• อ่านผล MIC คือ ความเข้มข้นของยาต่ำสุดที่เชื้อไม่สามารถเจริญได้

2. ทดสอบหา resistant mutant

• เตรียม MHA ผสมยาที่ต้องการทดสอบความเข้มข้น 0.25X MIC – 16X MIC
• spread เชื้อที่ต้องการทดสอบ ≥ 10¹⁰ CFU incubate 35 ^oC 24 ชั่วโมง
• นำเชื้อที่สามารถเจริญบน plate ความเข้มข้นมากกว่าหรือเท่ากับค่า MIC มายืนยันว่าเป็น resistant mutant จริงๆ

3. การทดสอบยืนยัน resistant mutant และหาค่า MPC : จากการทดสอบหา resistant mutant

ถ้ามีเชื้อขึ้น > 300 colonies

• ให้เลือกเชื้อมาทดสอบจากบริเวณที่ต่างกัน 4 จุด
• subculture ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มียา incubate 35 ^oC 18-20 ชั่วโมง
• ทดสอบเชื้อบน MHA ที่มียา 0.25X MIC – 16X MIC อีกครั้ง
• ถ้าได้ค่าเท่าเดิม แสดงว่าเชื้อที่เจริญเป็น resistant mutant และอ่านค่า MPC ได้
• ถ้าค่าที่ได้ต่ำกว่าเดิม แสดงว่าไม่ใช่ resistant mutant แต่การที่เชื้อเจริญได้เกิดจาก bacterial overcrowding

ถ้ามีเชื้อขึ้น ≤ 300 colonies และมี colony morphology ต่างกัน

• นำ colony ลักษณะต่างๆกัน มา subculture บนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มียาและทดสอบเหมือนกรณีที่เชื้อขึ้น > 300 colonies
• กรณีที่เชื้อเจริญมีลักษณะเป็น film (thin film or hazy growth) ให้ขูดเชื้อมา 1 loop และ subculture ลงบนอาหารที่ไม่มียา ถ้ามีเชื้อขึ้นให้ทดสอบเหมือนกรณี > 300 colonies

4. อ่านผล MPC และคำนวณค่า MPC/MIC ratio

Reference :

Credito K., Kosowska-Shick K., and Appelbaum PC. Mutant Prevention Concentrations of Four Carbapenems against Gram-Negative Rods. Antimicrob Agents Chemother, March 2010.

มีนักวิจัยได้เสนอทฤษฎีการแพร่กระจายของยีน blaNDM ดังนี้

ทฤษฎีการแพร่กระจายของยีน blaNDM

1. เชื่อว่ายีน blaNDM เป็นยีนที่มีอยู่ก่อนแล้วในเชื้อตามสิ่งแวดล้อมทั่วไป เพราะรายงานมักพบว่าที่บริเวณใกล้เคียงถัดจาก blaNDM เป็นยีนที่พบในแบคทีเรียอื่นๆ ที่พบได้ตามสิ่งแวดล้อม เช่นยีน groES และ groEL ดังแสดงในภาพ

ภาพแสดง genetic structure ของ blaNDM ในเชื้อต่างๆที่มีรายงาน

2. เชื่อว่าเชื้อ Acinetobacter species เป็นตัวแรกที่รับยีน blaNDM ก่อนจะส่งผ่านไปยังแบคทีเรีย genus อื่นๆ (เนื่องจากยีนที่พบเกี่ยวข้องกับ ISAba125 ทั้งหมด และ ISAba125 ที่สมบูรณ์พบแค่ใน Acinetobacter เท่านั้น) ด้วยกระบวนการ natural transformation รับเอายีนเข้ามาสู่ในเซลล์และยีนเกิดการเคลื่อนย้านมารวมตัวเข้ากับ chromosome หรือ plasmid ของ Acinetobacter spp. ซึ่งการรวมตัวของยีนอาจเกิดได้จาก 2 กลไก ตาม structure ของยีนที่มีรายงาน คือ

• ยีนเคลื่อนย้ายเข้ามารวมตัวเข้ากับ chromosome หรือ plasmid เพราะมีว่าตำแหน่งของยีนที่เหมือนกัน (homologous recombination) ของ TnaphA6
• หรือจากกลไกการเคลื่อนย้ายยีนด้วยวิธี rolling-circle transposition ของ ISCR ทำให้ได้ blaNDM เข้าไปด้วย

เมื่อ Acinetobacter spp. รับ blaNDM เข้ามาแล้วจะได้ยีนอยู่ใน transposon Tn125 แล้ว A.baumannii จะได้รับยีนผ่าน transposon นั้น

อย่างไรก็ตามมักไม่ค่อยมีรายงานการแพร่กระจายยีนดื้อยา ของ A.baumannii ไปให้เชื้อแบคทีเรีย genus อื่น เช่น blaOXA-23 ที่พบบ่อยใน A.baumannii มีรายงานเพียงครั้งเดียวในเชื้อ Proteus mirabilis ดังนั้นจึงเชื่อกันว่า transposon ที่มี blaNDM ต้องมีการเคลื่อนย้ายไปอยู่บน plasmid ที่เป็น broad-host range plasmid เสียก่อนจึงจะทำให้ plasmid นั้นแพร่กระจายไปยังเชื้อแบคทีเรียอื่นหลายชนิด

3. broad-host range plasmid ที่มี blaNDM มีการแพร่กระจายไปสู๋เชื้อที่คาดว่าเป็น final reservoir ได้แก่ เชื้อกลุ่ม Enterobacteriaceae และ Pseudomonas aeruginosa จะเห็นได้จากรายงานที่พบ blaNDM ในเชื้อกลุ่มนี้เป็นส่วนใหญ่

4. สุดท้าย final reservoir ก็จะเป็นแหล่งของการแพร่กระจายยีนไปยังเชื้อ genus อื่นๆ ที่สามารถรับ plasmid ดังกล่าวได้

อย่างไรก็ตามทั้งหมดเป็นเพียงทฤษฎีที่เชื่อว่าการแพร่กระจายของ blaNDM น่าจะเป็นแบบนั้น โดยดูจากข้อมูลที่เคยพบและมีรายงานไว้ แต่ก็อาจจะยังมีข้อมูลอีกบางส่วนที่ยังไม่ทราบก็เป็นได้

Reference :

Bonnin RA., Poirel L., and Nordman P. New Delhi metallo-beta-lactamase-producing Acinetobacter baumannii: a novel paradigm for spreading antibiotic resistance genes. Future Microbiol, January 2014.

ผลการศึกษา

• ภายใน 24 hr ที่เชื้อได้รับยา beta-lactams เซลล์จะเกิดภาวะ tolerance โดยเซลล์จะเปลี่ยนรูปร่างจากรูปแท่ง (normal rod shaped cells) เป็นเซลล์กลม (spherical cells) ดังภาพ

ภาพแสดงการเปลี่ยนแปลงรูปร่างเซลล์เมื่อได้รับยา A=0 hr, B=1 hr, C=4 hr, D=24 hr (3D-SIM microscopy)

• โดย spherical cells นั้นยังคงเป็นเซลล์ที่มีชีวิต(viable cells)ถึง 84% ย้อมติดสี syto9 ซึ่งเป็นสีเขียว แต่ถ้าเซลล์ตายจะติดสี propidium iodide และเห็นเป็นสีแดง ดังภาพ

ภาพแสดงการย้อมติดสีของ viable cells และ dead cells

• และมากกว่า 90% ของ spherical cells สามารถเปลี่ยนแปลงรูปร่างกลับไปเป็น rods และเจริญแบ่งเซลล์ต่อได้ในสภาวะที่ไม่มียา
• เมื่อดูโครงสร้างของ cell envelope ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็คตรอนแบบ TEM พบว่า outer membrane ของ spherical cells ถูกทำลายและไม่อยู่ติดกับเซลล์ ดังภาพ

ภาพแสดง outer membrane ของเชื้อเมื่อได้รับยา A,B=0 hr ; C,D=24 hr

• นอกจากนี้ Monahan และคณะยังได้ทดสอบผลของ antimicrobial peptides (AMPs) ต่อเชื้อที่เป็น spherical cells ซึ่งในสภาวะที่เชื้อเป็น normal rod shaped cells นั้น AMPs มีฤทธิ์ในการฆ่าเชื้อต่ำมาก และเมื่อใช้ carbapenem ร่วมกับ AMPs ทำให้ฆ่าเชื้อได้ดีขึ้น ดังภาพ

กราฟแสดง time kill curve ของ carbapenem และ AMPs (LL-37 และ Nisin)

จากการศึกษาของ Monahan และคณะในครั้งนี้จะเห็นว่าในสภาวะที่เชื้อ expose ต่อยา beta-lactams เชื้อจะเกิดภาวะ tolerance เปลี่ยนแปลงรูปร่างจาก rod ไปเป็น spherical cells โดยที่เชื้อยังคงมีชีวิตอยู่ แต่จะอยู่ในสภาพที่อ่อนแอเนื่องจาก outer membrane ของเซลล์มีปัญหา ดังนั้นจึงเป็นข้อดีที่จะใช้ยาหรือสารอื่นๆมาช่วยยับยั้งและฆ่าเชื้อให้ได้ผลดียิ่งขึ้น เช่นนการศึกษานี้ใช้ AMPs

แต่อย่างไรก็ตามก็มีข้อเสียเช่นกันเพราะ spherical cells ถึงแม้จะเป็นเซลล์ที่อยู่ในสภาพไม่สมบูรณ์ แต่ก็ยังเป็นเซลล์ที่มีชีวิตอยู่ และเมื่อใดก็ตามที่ปริมาณยาลดต่ำลงหรือหมดไปเชื้อก็จะกลับมาเจริญได้ใหม่ ดังนั้นในคนไข้ถ้าได้รับยาในปริมาณไม่เพียงพอก็จะไม่สามารถกำจัดเชื้อให้หมดไปได้ และอาจจะก่อให้เกิดเชื้อดื้อยาได้อีกด้วย

Reference : Monahan LG., Tumbull L., Osvath SR., et al. Rapid conversion of Pseudomonas aeruginosa to a spherical cell morphotype facilitates tolerance to carbapenems and penicillins but increases susceptibility to antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother, January 2014